台盼蓝和赤藓红 B 的性能比较说明

台盼蓝在许多实验室中是一种被认可的细胞计数染料，但它具有致癌性、环境破坏性和细胞毒性。赤藓红 B，通常也称为赤藓红、酸性红 51 或 FD&C 红 3 号，是一种生物安全且无毒的比色染料，可用作台盼蓝的替代品，用于细胞计数和活力评估.1使用赤藓红 B 染料排除法评估细胞活力的原理与台盼蓝类似，即完整的细胞膜可排除极性分子，而受损的细胞膜则不会。活细胞保持未染色，而死细胞被染色，外观较暗。

本技术说明展示了使用 CellDrop 自动细胞计数仪使用赤藓红 B 作为台盼蓝的替代品作为细胞活力染色剂。本技术说明还将使用赤藓红 B 和台盼蓝的细胞计数与 DeNovix AO/PI 荧光检测进行了比较，后者是两种染料（吖啶橙和碘化丙啶）的组合，经过优化，可在 CellDrop 上使用绿色和红色荧光通道对有核细胞进行准确计数和活力评估。

赤藓红素 B 作为台盼蓝替代细胞活力染料的准确性是通过在 PBS 中饥饿获取死细胞，然后将这些细胞与活细胞的各种混合物计数来确定的。将活力约为 12%（通过 AO/PI 评估）的饥饿 CHO 细胞与 95% 活细胞混合，结果表明，使用赤藓红 B 测定 CHO 细胞的活力与使用台盼蓝或 AO/PI（图 1）测定培养细胞一样有效。

Figure 1. CHO cells counted at different viabilities as determined on the CellDrop using Erythrosin B, Trypan Blue, and AO/PI methods. (A) Cell Viability, (B) Result image of CHO cells stained with EB, (C) Live Cells/mL, (D) Result image of CHO cells stained with TB, (E) Total Cells/mL, (F) Result image of CHO cells stained with AO/PI. Each bar represents an average of six (6) replicates per group. The error bars represent standard error of the mean (SEM) of the averaged replicates. (EB = Erythrosin B, TB = Trypan Blue, AO/PI = Acridine Orange and Propidium Iodide).

将活力低于 20% 且碎片水平高的 Jurkat 细胞也与 70% 至 30% 的高活力细胞混合。结果显示，三种 （3） 细胞活力染色剂之间的活细胞、混合细胞和死细胞的计数和活力分别相似（图 2）。

Figure 2. Jurkat cells counted at different viabilities as determined on the CellDrop using Erythrosin B, Trypan Blue, and AO/PI methods. (A) Cell Viability, (B) Live Cells/mL. Each bar represents an average of eighteen (18) replicates per group.The error bars represent standard error of the mean (SEM) of the averaged replicates. (EB = Erythrosin B, TB = Trypan Blue, AO/PI = Acridine Orange and Propidium Iodide).

图 3 显示了将制备的中低活力 Jurkat 传代稀释至三 （3） 细胞密度后获得的活力数据（图 3）。细胞活力检测结果在所有细胞密度和三种活力染色剂之间保持一致，而细胞数量保持稀释样品中预期的分离度。

Figure 3. Medium viability Jurkat cells counted at different densities as determined on the CellDrop using Erythrosin B, Trypan Blue, and AO/PI methods. (A) Cell Viability, (B) Result image of Jurkat cells stained with EB, (C) Live Cells/mL, (D) Result image of Jurkat cells stained with TB, (E) Total Cells/mL, (F) Result image of Jurkat cells stained with AO/PI. Each bar represents an average of five (5) replicates per diluted sample. The error bars represent standard error of the mean (SEM) of the averaged replicates. (EB = Erythrosin B, TB = Trypan Blue, AO/PI = Acridine Orange and Propidium Iodide).

材料和方法

通过在室温下在 PBS 中饥饿杀死 CHO 和 Jurkat 细胞，并按每种细胞类型特定的预定时间长度杀死。将 CHO 细胞分为四 （4） 组：活细胞，50% 活细胞与 50% 饥饿细胞的混合物，另一种 70% 饥饿细胞与 30% 活细胞的混合物，以及饥饿细胞;而 Jurkat 细胞被分成三 （3） 组：活细胞、每种细胞类型的饥饿细胞和活细胞混合比例为 70-30% 的组，以及饥饿细胞。使用赤藓红素 B 、 台盼蓝和 AO/PI 测量每组的活力。

为了确认赤藓红 B 在不同密度下与台盼蓝和 AO/PI 相比的准确性，将来自一周龄传代的低活力 Jurkat 细胞稀释成三种浓度（高、中和低浓度），并在 CellDrop 自动细胞计数仪上使用赤藓红 B、台盼蓝和 AO/PI 进行计数。

将研究中的三种染料制备至以下最终浓度。台盼蓝（Sigma 猫 #T8154） – 0.4% w/v. 赤藓红素 B（Sigma 猫 #198269）0.02% w/v 的 PBS 溶液，以及 AO/PI（DeNovix 猫 #CD-AO-PI-1.5）0.0005% w/v。每种都用于制备与细胞悬液的 1：1 稀释液。在计数前立即将每种染料添加到细胞样品中，并在加载到 CellDrop 上进行测量之前将样品轻轻混合。

使用台盼蓝应用程序对台盼蓝和赤藓红 B 染色的细胞进行计数。Normal exposure（正常曝光）设置用于台盼蓝计数。自定义曝光向导用于自动确定 0.02% 赤藓红素 B 的最佳曝光。使用 CHO 台盼蓝应用程序方案对台盼蓝和赤藓红 B 染色的 CHO 细胞进行计数，使用 Jurkat 台盼蓝应用程序方案对台盼蓝染色的 Jurkat 细胞进行计数。该方案经过修改以计数用赤藓红素 B 染色的 Jurkat 细胞。将赤藓红素 B 染色的 Jurkat 细胞的染色阈值从 30 个修改为 25 个，活圆度和死圆度从 65 和 20 分别修改为 35 个和 15 个。AO/PI 应用程序用于荧光计数，并应用了标准 CHO 和 Jurkat AO/PI 方案和建议。

数据显示，赤藓红 B 是台盼蓝细胞明场计数的有效替代品。 将这些明场结果与荧光 AO/PI 方法进行比较，可以参考一种特定于有核细胞且忽略样品中存在的碎片的方法，表明细胞系样品的所有三种活力测定方法都是一致的。所提供的数据表明，赤藓红 B 可以可靠地替代更危险且对环境更具破坏性的台盼蓝进行细胞计数，而无需额外的硬件。